Приготвяне на пробата

Процедурата Rusbiolink по -долу предоставя общи насоки за изготвянето на често тествани проби за използване в анализи на Mybiosource и Gentaur ELISA.

Свържете се с гентавър ЕООД в София за нашите подробни протоколи за подготовка на проби, които обхващат повече от 20 типа проби и очакваме да актуализираме това ръководство в близко бъдеще.

Моля, проверете в литературата за експерименти, подобни на
твоя за твоята нова разработка на анализи.

В общи линии:

1.  Концентрацията на протеинов екстракт е най-малко 1-2 mg/mL.
2.  Клетъчни и тъканни екстракти се разреждат с 50% със свързващ буфер.
3.  Пробите се центрофугират при 10 000 об / мин в продължение на 5 минути при 4 ° C, за да се отстрани всяка утайка преди употреба.

1. Супернатанти на клетъчната култура

Центрофугираща среда за клетъчна култура при 1500 об / мин за 10 минути при 4 ° С. Аликвотна супернатанта веднага и задръжте
-80 ° C, като се избягват цикли на замразяване/размразяване.

2. Клетъчни екстракти

Поставете плочите за тъканна култура върху лед. Отстранете средата за клетъчна култура и внимателно измийте клетките веднъж с ледено студен PBS. Отстранете PBS и добавете 0,5 ml екстракционен буфер на 100 mm плоча. Наклонете плочата и изстържете клетките в предварително охладена тръба. Разбъркайте за кратко и инкубирайте върху лед за 15-30 мин. Центрофугирайте при 13 000 об / мин за 10 минути при 4 ° C
(това създава пелета от неразтворимото съдържание). Разпределете аликвотата на супернатантата в чисти, охладени епруветки (върху лед)
и съхранявайте пробите при -80 ° C, като избягвате циклите на замразяване/размразяване.

3. Кондиционирани носители

Поставете клетките в пълна среда за растеж (със серум), докато се постигне желаното ниво на сливане.
Отстранете растежната среда и внимателно измийте клетките, като използвате 2-3 mL топъл PBS. Повторете стъпката на измиване. Премахване
PBS и внимателно добавете среда за растеж без серум. Инкубирайте 1-2 дни. Извадете носителя в центрофуга
тръба. Центрофугирайте при 1500 об / мин за 10 минути при 4 ° C. Разпределете аликвотата на супернатантата и съхранявайте пробите при -80 ° C, като избягвате
цикли на замразяване/размразяване.

4. Екстракт от тъкан

Кайма на лед в ледено студен буфер, за предпочитане в присъствието на протеазни инхибитори. Поставете тъканта вътре
микроцентрофужни епруветки и се потапят в течен азот, за да замръзнат. Съхранявайте пробите при -80 ° C за по -късна употреба или
дръжте на лед за незабавна хомогенизация.
За всеки 5 mg тъкан, добавете 300 µL екстракционен буфер към епруветката и хомогенизирайте, с ULTRA-TURRAX хомогенизатор блендер или ултразвук, сонификатор, клетъчен разрушител.

•  100 mM Трис, рН 7,4
•  150 mM NaCl
•  1mM EGTA
•  1 мМ EDTA
•  1% Triton X-100 0,5%
•  0,5% натриев дезоксихолат

(Тази част от буфера може да се приготви предварително и да се съхранява при 4 ° C. Непосредствено преди употреба,
буферът трябва да бъде допълнен с коктейл с инхибитор на фосфатаза [според указанията на производителя], протеаза
инхибиторен коктейл [според указанията на производителя] и PMSF до 1 тМ за генериране на пълен екстракционен буфер
решение.)

Изплакнете острието на хомогенизатора два пъти с 300 µL екстракционен буфер. Поставете пробата върху шейкър Gentaur при
4 ° C за 2 часа.

Центрофугирайте пробата за 20 минути при 13 000 об / мин при 4 ° C. Разпределете аликвотата на супернатантата в предварително охладени епруветки
в лед. Съхранявайте пробите при -80 ° C, като избягвате цикли на замразяване/размразяване.

Забележка: Rusbiolink съветва, че обемът на буфера на Lysis трябва да се определя според количеството на наличната тъкан. Типично
концентрацията на крайния протеинов екстракт е най -малко 1 mg/mL.

Ние също така доставяме много здрави и ниски цени на Gentaur ELISA Readers за 1750 евро на лаборатории в цяла Западна Европа и Русия.