микроРНК (miRNAs) са къси некодиращи РНК, които фино настройват генната експресия. Абералната експресия на miRNAs е свързана с много заболявания и те имат както терапевтичен, така и биомаркерен потенциал. Нашето разбиране за тяхната полезност зависи от инструментите, които имаме, за да ги изучаваме.

Предишни проучвания са установили необходимостта от оптимизиране и стандартизиране на методите за извличане на РНК, за да се избегнат пристрастни резултати. Тук ние извличаме РНК от миши белодробни, чернодробни и мозъчни тъкани, като използваме пет търговски налични метода за извличане на обща РНК.
Те включват или: фенол: екстракция с хлороформ, последвана от утаяване на алкохол (TRIzol), фенол: хлороформ, последвано от екстракция в твърда фаза (на базата на колона; miRVana и miRNeasy) и разделяне в твърда фаза с/без афинитетна смола (Norgen total и Изолат II ).
След това оценихме всеки метод на екстракция за качеството и количеството на възстановената РНК и експресията на miRNAs и целевите гени.

Резултати
Ние идентифицирахме разликите между всеки от методите за екстракция на РНК в количеството и качеството на пробите от РНК и в анализа на miRNA и експресията на целевия ген. За целите на последователност в количеството, качеството и високото възстановяване на miRNAs от тъканите, ние идентифицирахме, че фенол: разделянето на фазите на хлороформ, комбинирано с метод на твърда екстракция на базата на силициев диоксид, е за предпочитане (miRVana микроРНК изолация).
Ние също така идентифицирахме метод, който не е подходящ за анализ на miRNA от тъканни проби (Bioline Isolate II). За експресия на целеви ген всеки от комплектите може да се използва за анализ на иРНК, но ако се интересувате от анализ на иРНК и miRNA от същите проби от РНК, някои методи трябва да се избягват.

Изводи
Различните методи, използвани за изолиране на miPHK, ще дадат различни резултати и затова е необходим здрав метод за изолиране на РНК за възпроизводимост. Изследователите трябва да оптимизират тези методи за тяхното специфично приложение и да имат предвид, че методите за извличане на „обща РНК“ не изолират еднакво всички видове РНК.

Заден план
микроРНК (miRNAs) са семейство от къси (~ 22 нуклеотидни) некодиращи РНК, които са от съществено значение за контролиране на регулацията на генната експресия. Те действат чрез свързване към специфични последователности в 3'-нетранслираната област (3′-UTR) на тРНК, което води или до транслационна репресия, или до разпадане на съобщението. miRNAs са свързани с различни биологични процеси в нормалното развитие и променената им експресия е замесена в много заболявания, включително неврологични разстройства, имунни заболявания и рак [1]. Проучванията за профилиране на miRNA помогнаха да се изяснят техните критични роли в биологията на развитието, като регулиране на клетъчния цикъл [2], апоптоза [3] и диференциация [4]. Освен това променената им експресия в болестта ги прави привлекателни като диагностични и прогностични биомаркери и като мишени за манипулиране като терапевтични средства.

С нарастващия интерес към miRNAs, особено като диагностични и прогностични биомаркери, са разработени редица платформи за анализ на експресията на miRNA. Настоящите методи за откриване на miRNAs включват клониране, хибридизация in situ, микрочипове, поточна цитометрия на базата на перли, северно блотиране, секвениране от следващо поколение и количествена PCR в реално време (qRT-PCR) [5, 6]. Всеки от тези методи има своите предимства и недостатъци. Всички обаче разчитат на качеството на поставения материал. Методите за откриване като qRT-PCR и микрочипове зависят от предположението, че методът за екстракция на РНК изолира всички miRNAs еднакво [7,8,9]. Става очевидно, че тук е решаваща необходимостта от оптимизиране и стандартизиране на изолацията на miRNA, предвид различията между много проучвания, при които възстановяването на miRNAs зависи от използвания метод на екстракция [10,11,12,13,14,15 , 16]. Тези първоначални проучвания са фокусирани върху възстановяването на miRNA от плазма, урина и други телесни течности, но досега няколко статии сравняват разликите в ефективността на извличане на miRNA от твърди тъкани.

Разработването на miRNA за терапевтична употреба също изисква познаване на нейните специфични генни цели, област на изследване, която е в начален стадий. Следователно, може да е от особено значение за изследователите да анализират както miRNA, така и целевата генна експресия в една и съща проба от РНК.
Въпреки това, различните методи за извличане могат да се отклонят към изолиране на дълги или къси РНК, което потенциално може да повлияе на резултатите от изследването. Това изследване използва пет често използвани метода за изолиране на РНК за извличане на обща РНК, включително miRNAs от твърди тъкани, и сравнява ефективността на екстракция, качеството и добива на получените РНК.
Анализирахме miRNA и експресията на целевия ген, използвайки qRT-PCR от мозъчни, чернодробни и белодробни тъкани от мишки. Данните, представени тук, могат да послужат като полезна справка за изследователи, които се интересуват от анализ както на miRNA, така и на експресията на целевия ген в животинските тъкани за диагностична и прогностична употреба или валидиране на miRNA.