улесняването на клетъчната жизнеспособност и пролиферацията е основа за многобройни in vitro анализи на реакцията на клетъчната популация към външни фактори. Редукцията на тетразолиевите соли сега е широко приета като надежден начин за изследване на клетъчната пролиферация.

Ключовият субстрат на комплекта е: 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенил тетразолиев бромид или МТТ. МТТ е жълтеникав разтвор, когато се разтваря в балансирани разтвори на сол без фенолно червено и се поема от клетките поради нетния си положителен заряд.

Тетразолиевият пръстен на МТТ (жълт) се редуцира до лилави кристали формазан чрез вътреклетъчни NAD (P) Н-оксидоредуктази. Кристалите на формазана са неразтворими във воден разтвор, но се разтварят в предоставения буфер за разтваряне.

След разтваряне, полученият лилав разтвор се измерва спектрофотометрично. Тестът за клетъчна пролиферация на MTT измерва скоростта на клетъчната пролиферация и обратно, когато метаболитните събития водят до апоптоза или некроза, намаляването на клетъчната жизнеспособност. Броят на стъпките на анализ е минимизиран, доколкото е възможно, за да се ускори обработката на пробата.

Реагентът MTT дава ниски стойности на абсорбция на фона при липса на клетки. За всеки тип клетка се установява линейна връзка между броя на клетките и произведения сигнал, като по този начин се позволява точно количествено определяне на промените в скоростта на клетъчната пролиферация.

Ако сте запознати с процедурата и знаете броя на клетките, които да използвате в конкретния си анализ, можете да следвате този основен протокол.

Семенни клетки в 96-ямкова плака при плътност от 2000 клетки/ямка (за анализ на пролиферация) или 5000 клетки/ямка (анализ за токсичност) в 100 ul културна среда (в зависимост от клетъчния тип)
Инкубирайте за подходящо време според експериментите и третирайте с веществото, което ще се анализира.

Добавете 10 μl MTT реагент
Инкубирайте клетките за 3-4 часа в инкубатора. В клетките се образуват тъмнокафяви кристали формазан. За по -висока плътност на клетките, инкубационното време може съответно да се съкрати.
Добавете 100 μl разтворен разтвор на Formazan.
Инкубирайте за около 4 часа при 37 ° C, когато пурпурната утайка се разтвори напълно.
Рекордна абсорбция при 560-600 nm.
Забележка:

Поради използването на 96 -ямкови плочи за тестване, ако клетките се култивират дълго време, трябва да се обърне внимание на проблема с изпарението. От една страна, тъй като кръгът около отвора на 96 ямка е най -лесен за изпаряване, кръгът около него може да бъде отхвърлен или да се използва PBS, вода или хранителен разтвор; От друга страна, 96 -те плочи могат да бъдат поставени близо до водата в шкафа, за да се облекчи изпарението.
Ако Formazan е замразен или произвежда валежи, 56 ℃ водна баня може да се поддържа, за да се стимулира разтварянето, и трябва да се използва след разтваряне и смесване абсолютно.
Разтворът на MTT е жълт, трябва да се избягва запазването на светлината, дългата светлина може да доведе до повреда. Когато цветът се превърне в зелен градински чай, той няма да се използва.
Извършване на анализ
Графикът на данните, получени в Стъпка 7 (абсорбция спрямо броя клетки), трябва да осигури крива с линейна част. Оптималният брой клетки за анализа трябва да попадне в линейната част на кривата и да даде стойност на абсорбция между 0,75 и 1,25. След това може да се измери както стимулирането, така и инхибирането на клетъчната пролиферация. За най -добри резултати трябва да се използват клетки в лог фаза на растеж и крайният брой клетки не трябва да надвишава 106 клетки/cm2. Всеки експеримент трябва да включва празна проба, съдържаща всички реактиви в ямка без клетки. Анализите ще включват:

Празни ямки, съдържащи само среда.
Нелекувани контролни клетки.
Тестови клетки, третирани с веществото, което ще се анализира.
Ако се използва повече от 100 μl среда на ямка, увеличете съответно количеството на MTT реагента; например, за 250 μl среда използвайте 25 μl реагент MTT.